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如何使用賽默飛nanodrop紫外分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量

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   賽默飛nanodrop紫外分光光度計(jì)是一種廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)儀器,其通過(guò)測(cè)量物質(zhì)在紫外光區(qū)的吸收特性來(lái)進(jìn)行定性和定量分析。在蛋白質(zhì)定量方面,紫外分光光度計(jì)因其操作簡(jiǎn)便、快速且不需要復(fù)雜設(shè)備而備受青睞。本文將詳細(xì)介紹如何使用賽默飛nanodrop紫外分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量的步驟和原理。
 
  一、實(shí)驗(yàn)原理
 
  紫外-可見(jiàn)分光光度法基于溶液中物質(zhì)的分子或離子對(duì)紫外和可見(jiàn)光譜區(qū)輻射能的選擇性吸收。對(duì)于蛋白質(zhì)而言,其內(nèi)部的酪氨酸和色氨酸殘基中的苯環(huán)含有共軛雙鍵,這些基團(tuán)在275-280nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有一個(gè)強(qiáng)烈的吸收峰。因此,可以通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度(A),利用朗伯-比爾定律(A=ebc)來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)的濃度。其中,A為吸光度,e為摩爾吸光系數(shù),b為光程長(zhǎng)度,c為濃度。
 
  二、實(shí)驗(yàn)材料
 
  儀器:TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、石英比色皿(1cm光程)
 
  試劑:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(如牛血清白蛋白BSA,已知濃度)、待測(cè)蛋白質(zhì)溶液、0.9%NaCl溶液(作為參比溶液)、雙縮脲試劑(用于其他方法時(shí)可選擇)、苯酚試劑(用于其他方法時(shí)可選擇)
 
  工具:吸量管、比色管、擦鏡紙等
 
  三、實(shí)驗(yàn)步驟
 
  1.儀器準(zhǔn)備
 
  開(kāi)機(jī)預(yù)熱:打開(kāi)紫外分光光度計(jì)電源開(kāi)關(guān),預(yù)熱20-30分鐘。
 
  波長(zhǎng)設(shè)置:預(yù)熱完成后,按GOTOλ鍵,輸入所需的波長(zhǎng)(如280nm),按ENTER鍵確認(rèn)。
 
  2.參比溶液設(shè)置
 
  清洗比色皿:用擦鏡紙輕輕擦拭比色皿的光滑面,確保其干凈無(wú)污漬。
 
  參比溶液加入:向比色皿中加入適量的0.9%NaCl溶液,輕輕搖勻后放入光度計(jì)凹槽中,蓋好蓋子。
 
  調(diào)零:按ZERO鍵進(jìn)行調(diào)零操作,確保儀器讀數(shù)準(zhǔn)確。
 
  3.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
 
  溶液稀釋:使用吸量管吸取已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液,加入比色管中,用0.9%NaCl溶液稀釋至不同濃度(如0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL等)。
 
  吸光度測(cè)量:將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液依次加入比色皿中,在280nm波長(zhǎng)下測(cè)量各溶液的吸光度,并記錄數(shù)據(jù)。
 
  繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
 
  4.待測(cè)樣品測(cè)定
 
  樣品準(zhǔn)備:將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液用0.9%NaCl溶液稀釋至適當(dāng)濃度。
 
  吸光度測(cè)量:將稀釋后的待測(cè)樣品加入比色皿中,在280nm波長(zhǎng)下測(cè)量其吸光度。
 
  濃度計(jì)算:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,查找或計(jì)算待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。
 
  四、注意事項(xiàng)
 
  儀器預(yù)熱:確保儀器預(yù)熱足夠時(shí)間,以提高測(cè)量精度。
 
  比色皿清潔:比色皿應(yīng)保持干凈,避免劃痕和污漬影響測(cè)量。
 
  波長(zhǎng)設(shè)置:根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置正確的波長(zhǎng),通常為280nm。
 
  參比溶液:參比溶液應(yīng)與待測(cè)溶液具有相似的物理和化學(xué)性質(zhì),以減少誤差。
 
  樣品稀釋:待測(cè)樣品應(yīng)稀釋至適當(dāng)濃度,以避免吸光度超出儀器測(cè)量范圍。

TEL:18016231680

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